色谱方法开发：分离度

前言
对于色谱工作者而言，面对复杂成分的检测，分离是首要的关注点。无法有效分离意味着无法进行准确的定性、定量检测。
说起分离，有必要再介绍一下色谱。了解、理解并掌握色谱分离原理很重要，对于大多数接触了色谱分离的人而言，应该了解的基于不同分离原理的主要色谱技术包括吸附色谱、分配色谱、离子交换色谱、亲和色谱、大孔吸附树脂、凝胶色谱等。如果说上面这一系列名词还稍显陌生，那么根据分离方法所分类的纸色谱法、薄层色谱法、柱色谱法、气相色谱法、高效液相色谱法等，应该更广为熟知了。
无论是何种分离色谱，对于目标成分的分离均有相应要求。以中国药典通则0500色谱法项下的相关描述为例，薄层色谱中要求“除另有规定外，分离度应大于1.0”，高效液相色谱法、离子色谱法及气相色谱法等要求“除另有规定外，待测物质色谱峰与相邻色谱峰之间的分离度应不小于1.5”，分子排阻色谱法中要求“除另有规定外，分离度应大于2.0”。
从上述要求中可以直观的看出，不同色谱技术对于分离度的要求不尽相同，至于个中缘由我们暂不揣度。只是有一点很重要：分离度不是指导原则等文件规定死的一个参数，正如大多技术参数一样，始终是为了满足使用目的而进行的“私人订制”，量后裁！
本文主要以高效液相色谱法为例，抛砖引玉谈一下系统适用性中“分离度”这个参数，以期对该参数有一个更为深入的思考和认知，其中的案例也希望能给实际工作一些借鉴。
什么是基线分离？
基线分离是每一个色谱分离工作者在兼顾效率前提下的终极追求。理论上，当分离度等于1.5时，即可认为达到了基线分离。为什么是“即可认为”，而不是绝对认为呢？这里面涉及到正态分布/高斯分布，3σ，6σ等概念。这些概念稍显顽固，我们给予记过并留待察看，暂不深入追究。用点色谱参数里常用的名词，再加一点通俗语言来说就是，对称因子为1.0的两个高矮胖瘦一模一样的色谱峰，当分离度为1.5时可认为是基线分离。比如，下图1显示的某药典给出的有点标准的示例图。

图1  基线分离示例
但是，理论指导实践，实践是检验真理的唯一标准。比如说，上面对于基线分离的描述情形，在实际工作中基本不可能，而且说“基本”是为了满足“一切皆有可能”的严谨，否则可以直接说“根本不可能”。因为德国哲学家莱布尼茨说，世界上没有完全相同的两片树叶，而每一个色谱工作者都可以说，世上没有完全相同的两个色谱峰。
实际情况是，往往相邻色谱峰各有千秋，导致同一个分离度会出现完全不同的分离效果。比如下图2，两个不同比例的色谱峰，在不同分离度情况下的分离表现，在分离度0.6时尤为明显：当后峰是前峰的1/16时，还能看出是两个峰吗？
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图2 分离度及谱峰相对大小（面积）与分离度关系《实用高效液相色谱法的建立》
既然如此，那我们就不要再执念于分离度1.5了，也不要自欺欺人的出具一个显示分离度大于1.5的色谱报告而不看实际分离效果了。