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色谱方法如何建立？梯度方法如何调整？一直是困扰广大色谱研究人员的一个问题，梯度方法怎么调整，注意问题有哪些？今天小编就与大家聊一聊梯度。
梯度洗脱的原理
典型的梯度洗脱是用两种溶剂做流动相，弱溶剂A和强溶剂B，在反相色谱分离中溶剂A大都是水，溶剂B是甲醇或者乙腈等强溶剂。所有的梯度洗脱中溶剂强度不断增加，即B的浓度不断增加。例如,流动相中溶剂B的含量在一定时间内梯度从20%提高到80%。梯度控制器决定流动相的组成，可通过输入不同的条件实现：
①流动相(梯度洗脱开始时): cB(%);
②流动相(梯度洗脱结束时): cB(%);
③从分离开始到结束的梯度时间;
④ 梯度形状;
⑤流速。
梯度洗脱常用于分离极性范围广的组分，最后一个峰的等度保留必须大于第一个峰。在等度分离中，第一个峰与最后一个峰的k'比应大于30，这样用梯度才有好的结果。用等度分离在色谱图中前面的峰挤在一起，后面的峰又拉得很开(图a)。用梯度洗脱峰间的位置很平均，分离度好，后面的峰很窄，检测方便(图b)。在等度洗脱中前面峰的k'值很小，后面峰的k'很大，梯度洗脱使流动相强度不断变化改变了k'值。在梯度洗脱中，弱保留组分在弱流动相中首先离开色谱柱，而强保留组分在强流动相中最后离开色谱柱。
(a)梯度洗脱：甲醇-水,甲醇浓度从10%至100%;
(b)等度洗脱,甲醇-水,体积比=50:50;
1-苯;2-氯苯;3-对-二氯苯;4-1,2,3-三氯苯;5-1,3,5-三氯苯;6-1,2,4-三氯苯;7-1,2,3,4-四氯苯;8-1,2,4,5-四氯苯;9-四氯苯;10-六氯化苯
如果CB开始太大，先出来的峰分得不好，是开始出的峰k'太小。如果先出来的峰挤在一起，应把开始的CB降下来。以最终CB值控制最后的峰的洗脱时间。
开始试验时很可能有一对或更多的峰未完全分开，就像等度分离那样。也应该像改善等度分离那样改善梯度的分离度，可以优化k'、N和α。虽然初接触时不太适应梯度洗脱模式，但实际上它比等度洗脱更为方便容易。用这种模式的主要困难是，选定依赖于开始和最后CB的k'值、梯度时间tG、柱体积Vm以及流速F。它们的关系如下:
梯度洗脱中，k'视为常数，在反相液相色谱中大约等于20，△CB(%)为最终的cB(%)减去开始的cB(%)。柱体积等于FtG(150mmX0.46cm柱大约1.5mL)。增加梯度时间和流速，减少柱长和梯度变化范围就增加k'。在梯度洗脱中，增加k'就可获得与等度分离相同的结果：宽峰、较长的分离时间、良好的分离度。
在梯度洗脱中增加N值也可增加分离度,用较长的柱、高效柱或减少流速可增加N值。根据上式改变柱长和流速会影响到k'。增加N值会导致较小的是k'值，从分离度方面考虑会有相反的作用。在梯度洗脱中增加N可以保持是k'值恒定。改变F或柱长，保持tGF/Vm恒定，则k'也会恒定。
梯度洗脱出现的问题
总体讲，梯度洗脱中所出现的故障与等度洗脱非常类似，主要包括以下方面：第一是与仪器故障实验技术、色谱柱故障等有关；第二是由于试验条件不当设置导致分离方面问题(分离度差、宽峰等)。下表汇总了梯度洗脱常见故障及解决方法。
现 象
问题
解决办法
色谱图前面的峰挤成一团,且分离度较差
起始流动相太强
在开始的梯度中减少溶剂B的比例(%)
色谱图中间峰分离度差
条件欠佳
增加k'、N和α,改变梯度时间、流速、柱长
色谱图前面的峰保留不重复
柱平衡差
(1)增加两次梯度之间的再生时间(2)—定的间隔进样
基线漂移
溶剂A和B有不同的紫外吸收值
(1)加非保留的紫外吸收剂以抵消溶剂吸收的波动;(2)用不同波长检测;(3)用不同检测器
在空白的梯度中有伪峰
试剂或流动相不纯
(1)用HPLC级试剂(2)纯化流动相的组分
部分色谱峰分离度突然变差
溶剂分层
用键合相柱代替多孔硅胶柱
(1)基线漂移
如果B溶剂(甲醇)比A溶剂(水)吸收大，梯度洗脱时基线上升，在低紫外波长检测更加厉害。一个解决的办法是加有紫外吸收的组分到A或B溶剂中，以均衡两种溶剂的吸收。加紫外吸收剂的一个要求是在梯度洗脱条件下无保留。也可加氧化亚氮在A(水)中。在185nm〜200nm 处检测常加低浓度的硝酸盐；在高检测波长加周期表中高族的盐(如溴酸盐、 高碘酸盐)。
(2)伪峰
在流动相中存在有紫外吸收的杂质，用梯度洗脱能分离出来，即不进相关的样品也照常出峰。如用普通的蒸馏水或含有杂质的溶剂就会不断出峰或基线漂移，建议用HPLC级的水和溶剂。
(3)溶剂分层
在梯度洗脱中用硅胶柱最易出现这种现象。若B溶剂活性很强(如丙醇)，A溶剂极性很弱(如正己烷)。在梯度初始阶段B溶剂被柱所吸收，继续梯度B溶剂就打破平衡。可能在色谱图上某些点分离度明显降低，个别峰特别窄，而两侧峰又比较宽。在窄峰这一点上，正好B溶剂破坏了平衡，然后又分层。分析时要注意选用对B溶剂吸收低的柱，用键合相的柱很少发生这种现象。
溶剂的互溶性，不相混溶的溶剂不能用作梯度洗脱的流动相，有些溶剂在一 定比例内混溶，超出范围就不互溶，使用时更要引起注意。当有机溶剂和缓冲液混合时，还可能析出盐的晶体，尤其使用磷酸盐时需特别小心。
梯度滞后体积
梯度滞后体积是指从溶剂配比完成点到色谱柱头的系统体积，也可称为延缓体积，相当于在梯度运行之前运行一段等度条件。下图是低压梯度与髙压梯度系统中滞后体积的示意图。
滞后体积的差异是造成梯度重现性差和方法传递困难的根源之一。系统体积较大时，由于梯度的谱带展宽作用，会改变预期的梯度形状，使得不同HPLC系统之间难以进行方法转换。下图是理想情况下和不太理想的梯度滞后曲线的示意图。
传统HPLC系统滞后体积一般在0.5mL〜5mL范围，通常采用4.6mm内径，150mm或更长的色谱柱，分析时间10min〜20min之间或更长时，滞后体积的影响并不显著。但是随着柱长变短、内径变细，较大的滞后体积可能会引起保留时间明显增加，色谱分离情况发生变化，因此，当用细内径色谱柱进行分离时，滞后体积太大会引起梯度变化的延迟。
