科学家们如何开发迅速并可靠的诊断方法？

自新冠病毒疾病（COVID-19）疫情爆发以来，截至2月22日，世界卫生组织的统计表明，全球有77794名患者确诊被新冠病毒（SARS-CoV-2）感染，其中中国确诊病例为76392例。为了准确诊断和记录感染的传播，医生对迅速和可靠的检测手段的需求非常大。而近几周来，在多个科学团队不懈的努力下，从发现新冠病毒的基因组到多种分子测试手段的开发，对于新冠病毒的分子检测在很短的时间里获得了飞速的进展。在今天的这篇文章里，药明康德内容团队将结合《自然》子刊Nature Technology上的报道与公开资料，回顾新冠病毒的分子检测开发的历程，并展望其未来的发展方向。

发现新冠病毒的“分子指纹”

当COVID-19疫情最初爆发时，三个不同的研究团队不知疲倦地工作，力图早一天发现COVID-19爆发的原因。由上海、武汉、北京和悉尼的研究人员组成的团队使用宏基因组（metagenomic）RNA 测序，从一名在武汉海鲜市场工作的患者中发现了一种以前未知的冠状病毒。这一团队在1月10日首次将它的初步基因组序列存放在公开的GenBank数据库中。

几乎同时，中国疾病控制和预防中心派遣的迅速反应团队从3名患者的支气管肺泡灌洗液中分离并培养出一种新型冠状病毒。电镜图像表明这一病毒具有典型的冠状病毒形态。基因组测序表明它与蝙蝠中和SARS类似的冠状病毒具有85%的相似性。在1月12日，这一研究团队将3个基因组序列存放在可公开查询的GISAID数据库中。

第三个来自武汉和北京的研究团队，从另外5名严重肺炎患者中发现了同一病毒，并且将5个基因组序列存放GISAID数据库中。他们同时发现这一病毒使用ACE2受体进入宿主细胞，这一侵入方式与SARS-CoV相同。

如果说新冠病毒是在人体中搞破坏的“罪犯”，那么发现新冠病毒的基因组就如同找到了“罪犯”的指纹。这给研究人员开发确诊新冠病毒的分子检测奠定了基础。

开发分辨“分子指纹”的“放大镜”

找到了新冠病毒的“分子指纹”还不够，在疫情现场确诊新冠病毒患者，医生们还需要发现和识别“分子指纹”的工具。如同对指纹的分析需要将指纹放大，观察纹路中的细微特征，研究人员也需要将患者样本中少量的新冠病毒基因组扩增，并且发现其中的独特特征的“放大镜”。

由于新冠病毒是一种以前从未见过的冠状病毒，市场上并没有针对这一病毒的商业检测。多个国际研究团队基于存放在公开数据库中的基因组序列迅速开发出基于聚合酶链反应（PCR）技术的检测手段。PCR技术简单来讲，能够在一个小小的试管中，将DNA片段轻易地复制上几百万倍！这一技术极其简单，所需的不过是一些搭建DNA的材料，一些酶，以及一些温度的变化而已。

PCR的技术原理（图片来源：Enzoklop [CC BY-SA 3.0]）

在1月23日，德国的研究人员，与欧洲和香港的科学家们合作，发布了检测SARS-CoV-2的实时荧光定量PCR（real time-PCR，RT-PCR）检测的细节和流程。这一检测能够将SARS-CoV-2与SARS-CoV区分开。这一检测成为世界卫生组织（WHO）使用的SARS-CoV-2分子检测试剂盒的基础。近几周来，WHO已经向世界上159个检测实验室运送了25万个分子检测试剂盒。

同时，香港大学的研究团队根据最初在GenBank中存放的基因组序列，开发出两种RT-PCR检测。它们分别扩增新冠病毒基因组中两个不同的区域——ORF1b和N区域。这一研究团队与WHO，以及在亚洲、非洲、中东和南美的超过30个实验室分享了检测细节和试剂。

美国的疾病预防和控制中心在2月4日获得FDA授予的紧急使用授权（EUA）之后，也推出自己的PCR检测。这些检测在美国50个州和30个世界上其它地点使用。

这些早期开发的检测手段为研究人员和医生们争取到宝贵的时间。在商业化试剂盒大量生产之前，它们为公共卫生机构提供了一些诊断新冠病毒感染患者的工具。

新冠病毒分子诊断的发展方向

然而，基于PCR的分子诊断试剂盒也有它的缺陷。首先，基于RT-PCR的试剂盒的使用不只需要试剂本身，而且需要运作RT-PCR的精密仪器和经过训练的操作人员。目前，在疫情前线工作的医生们需要将患者样本送到专门的中心实验室进行检测，然后中心实验室再将检测结果传回给医生们。一来一往可能需要一天的时间。在争分夺秒的疫情一线，一天对控制患者病情的发展和疫情的传播来讲都显得太长了。

而且，由于需要在短期内开发出检测手段，现有试剂盒中的试剂和测试条件可能没有得到进一步的优化，这将会影响检测本身的灵敏度和特异性，出现“假阳性”和“假阴性”结果。另外，目前我们对SARS-CoV-2病毒释放的途径和动力学特征尚不完全清楚，因此使用哪种临床样本进行检测能够得到最佳效果仍然没有得到确定。

近日世界卫生组织召开的新冠病毒研究和创新大会上，与会专家们的共识之一就是需要开发更为快速简便，让一线医务人员就能够使用的可靠诊断检测。世界各地的研究人员也在使用不同的技术，让新冠诊断检测更为快速、简便和准确。

将中心实验室“搬到”疫情一线

目前，RT-PCR检测的一个瓶颈是需要将样本运送到中心实验室进行检测。如果能够在疫情一线完成RT-PCR检测，将给医务人员节省很多时间。例如，沿着这个开发方向，香港科技大学的研究人员已经开发出一种能够在疫情一线进行快速诊断的分子检测系统，它整合了微流控技术和硅基的微型加热原件，能够在40分钟内给出检测结果。这一技术平台已经获得欧盟的CE批准。

欧洲的Novacyt公司开发的便携式RT-PCR仪器，能够在两个小时内获得检测结果，它已经获得CE批准。在2月17日启动了只供研究的测试，并且在寻求美国FDA的紧急使用授权。

Qiagen和Biomeme公司也开发了将样本处理和RT-PCR检测整合在一起的可移动检测仪，让对样本的检测更为自动化，并且可以在疫情一线进行。

基于CRISPR技术的分子诊断检测

在RT-PCR以外，CRISPR技术在诊断病原体感染方面也表现出了巨大的潜力。CRISPR技术的两位先驱Jennifer Doudna教授和张锋教授就曾分别参与创建Mammoth Biosciences和Sherlock Biosciences两家初创公司，利用CRISPR技术，开发简易灵敏的诊断测试。

日前，张锋教授的团队，开发了一种基于CRISPR技术检测新冠病毒RNA的方法。从纯化的核酸分子样本开始，只需要简单的3步，就能在一个小时的时间里完成检测。它的优势在于不需要复杂的仪器，最后的检测在试纸上进行。虽然目前这一手段尚未用在患者样本上，还不能直接用于临床诊断，但是张锋教授的团队欢迎与其它研究人员合作，进一步开发这一技术的临床应用。

通过条带的不同位置，我们可以判断有没有新冠病毒的存在（图片来源：参考资料[5]）

基于基因测序的诊断和疫情监视工具

另一种将诊断和疫情监视合二为一的分子检测工具是使用基因组测序发现新冠病毒的基因组特征。这种检测系统首选对患者的样本进行基因组测序，然后通过对测序数据的宏基因组分析，发现包括新冠病毒在内的多种病原体的序列特征。

虽然基因组测序与PCR相比成本更高，但是它的优点在于能够同时对多种病原体进行监测，而基于PCR的检测往往只能用于发现单一的病原体。

而且，因为这种技术获得的数据是病原体的序列，研究人员可以记录新冠病毒的基因组序列的变化，从而跟踪新冠病毒的进化和流行病学进展。例如，IDbyDNA公司开发的检测能够发现超过900种呼吸系统病原体，从获得样本到给出结果只需要36个小时。而且一旦一种全新的病原体出现，这一系统不需要改变测序环节，对数据分析的软件进行修改就可以用于检测和监控新的病原体。

参考资料：

[1] Coronavirus and the race to distribute reliable diagnostics. Retrieved February 22, 2020, from https://www.nature.com/articles/d41587-020-00002-2.

[2] Sherlock Biosciences. Retrieved February 22, 2020, from https://sherlock.bio/

[3] Mammoth Biosciences. Retrieved February 22, 2020, from https://mammoth.bio/

[4] Coronavirus disease 2019 (COVID-19) Situation Report – 33. Retrieved February 23, 2020, from https://www.who.int/docs/default-source/coronaviruse/situation-reports/20200222-sitrep-33-covid-19.pdf?sfvrsn=c9585c8f_2

[5] A protocol for detection of COVID-19 using CRISPR diagnostics, Retrieved February 14, 2020, from https://static1.squarespace.com/static/5b7c640be2ccd1703a3da4d3/t/5e46d16cf617da2f796f926e/1581699437272/COVID-19+detection+%28v20200214%29.pdf