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一，朗伯-比尔定律的意义
朗伯-比尔定律是光吸收的基本定律，适用于所有的电磁辐射和所有的吸光物质，包括气体、固体、液体、分子、原子和离子。比尔-朗伯定律是吸光光度法、比色分析法和光电比色法的定量基础。光被吸收的量正比于光程中产生光吸收的分子数目。
二，朗伯-比尔定律定义
朗伯-比尔定律：光被透明介质吸收的比例与入射光的强度无关；在光程上每等厚层介质吸收相同比例值的光。
A=lg(1/T)=Kbc
（A为吸光度；T为透射比, 即透射光强度与入射光强度之比；c为吸光物质的浓度,单位mol/L；b为吸收层厚度，单位cm ）
三，朗伯-比耳定律成立的条件
(1) 入射光为平行单色光且垂直照射。
(2) 吸光物质为均匀非散射体系。（必须是透明溶液）
(3) 吸光质点之间无相互作用。
(4) 辐射与物质之间的作用仅限于光吸收，无荧光和光化学现象发生。
四，偏离朗伯-比尔定律的原因
在分光光度分析中，比尔定律是一个有限的定律，其成立条件是待测物为均一的稀溶液、气体等，无溶质、溶剂及悬浊物引起的散射；入射光为单色平行光。导致偏离朗伯-比尔定律的原因很多，但基本上可分为物理和化学两个方面。物理方面主要是入射光的单色性不纯所造成的；化学方面主要是由于溶液本身化学变化造成的。
(1)单色光不纯引起的偏离
严格说来，朗伯-比尔定律只适用于单色光。但由于仪器分辩能力所限，入射光实际为一很窄波段的谱带。由于分光光度计分光系统中的色散元件分光能力差，即在工作波长附近或多或少含有其他杂色光，杂散光(非吸收光)也会对比尔定律产生影响，这些杂色光将导致朗伯-比尔定律的偏离。
实际上，理论上的单色光是不存在的，我们所做的只能是让入射光的光谱带宽尽可能的小，要尽可能的靠近单色光。
(2)溶液本身性质引起比尔定律的偏离
1、样品溶液浓度的影响
比尔定律是一个有限的定律，它只适用于浓度小于0.01mol/L的稀溶液。因为浓度高时，吸光粒子间的平均距离减小，受粒子间电荷分布相互作用的影响，他们的摩尔吸收系数发生改变，导致偏离比尔定律。因此，带测溶液的浓度应该控制在0.01mol/L以下。
还有人认为：因为当被测物质在溶液中浓度较大时，量子光学认为，吸光粒子的相互作用加强，吸光能力下降；溶液的折光指数(n)随溶液的浓度改变而变化，并对吸光度有影响。当溶液浓度低于0.01mol/L时，n基本上是一常数，这也说明朗伯-比尔定律只有在低浓度中应用才是正确的。
2、溶质和溶剂的性质
例如，碘在四氯化碳溶液中呈紫色，在乙醇中呈棕色，在四氯化碳溶液中即使含有1%乙醇也会使碘溶液的吸收曲线形状发生变化。这是由于溶质和溶剂的作用，生色团和助色团也发生相应的变化，使吸收光谱的波长向长波长方向移动或向短波长方向移动，即所谓的蓝移和红移。
3、介质不均匀性
朗伯-比尔定律是适用于均匀、非散射的溶液的一般规律，如果被测试液不均匀，是胶体溶液、乳浊液或悬浮液，则入射光通过溶液后，除了一部分被试液吸收，还会有反射、散射使光损失，导致透光率减小，使透射比减小，使实际测量吸光度增大，使标准曲线偏离直线向吸光度轴弯曲，造成对朗伯-比尔定律的偏离。
所以，在分析条件选择时，应考虑往样品溶液的测量体系中加入适量的表面活性剂等来改善溶质的均匀度。
4、溶质的离解、缔合、互变异构及化学变化
比尔定律在有化学因素影响时不成立。解离、缔合、生成络合物或溶剂化等会对比尔定律产生偏离。离解是偏离朗伯-比尔定律的主要化学因素。溶液浓度的改变，离解程度也会发生变化，吸光度与浓度的比例关系便发生变化，导致偏离朗伯-比尔定律。
溶液中有色质点的聚合与缔合，形成新的化合物或互变异构等化学变化以及某些有色物质在光照下的化学分解、自身的氧化还原、干扰离子和显色剂的作用等，都对遵守朗伯-比尔定律产生不良影响。
来自出射狭缝的光，其光谱带宽度大于吸收光谱带时，则投射在试样上的光就有非吸收。这不仅会导致灵敏度的下降，而且使校正曲线弯向横坐标轴，偏离朗伯-比尔定律。非吸收光越强，对测定灵敏度影响就越严重。并且随着被测试样浓度的增加，非吸收光的影响增大。当吸收很小时，非吸收光的影响可忽略不计。
单色光的影响
严格讲，朗伯－比耳定律只适用于单色光，但目前用各种方法所得到的入射光实际上都是复合光。由于物质对不同波长的光的吸收程度不同，所以会引起对朗伯比耳定律的偏离。减免方法：尽量使入射光的波长范围窄。
化学因素的影响
严格讲，朗伯－比耳定律要求吸光质点间无相互作用。但实际工作中存在相互作用，并且吸光物质浓度越大，相互作用也越大，偏离朗伯－比耳定律的程度也越严重，所以吸光分析应在稀溶液中进行。
五，朗伯比尔定律的发展
物质对光吸收的定量关系很早就受到了科学家的注意并进行了研究。皮埃尔·布格（Pierre Bouguer）和约翰·海因里希·朗伯（Johann Heinrich Lambert）分别在1729年和1760年阐明了物质对光的吸收程度和吸收介质厚度之间的关系；1852年奥古斯特·比尔（August Beer）又提出光的吸收程度和吸光物质浓度也具有类似关系，两者结合起来就得到有关光吸收的基本定律——布格－朗伯－比尔定律，简称朗伯－比尔定律。
六，分光光度计的种类与区别
紫外可见分光光度计与可见分光光度计的区别
两者是测定波长范围不同，紫外一般用氢灯，测定波长范围180～350nm,可见一般用钨灯，测定波长范围320～1000nm。所谓紫外可见分光光度计也就是说这个仪器可以更换光源，能够测定吸收峰在紫外和可见光部分的化合物。用紫外分光时一定要用石英比色皿，不能用玻璃比色皿，因为紫外线很难透过玻璃的。
吸光度值一般不超过2，超过2时不显示是正常现象。因为吸光度是透光率的负对数，吸光度超过2就是说透光率小于1％，低于仪器的检出限，就不再显示了。
至于置于如何选择分光光度计，取决于你测定的波长。
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