超临界流体色谱法在药物成分分析中的应用
在手性药物成分分析中的应用据统计，手性药物约占临床药物数量的一半左右。这些手性药物的药效不尽相同，可以分为以下四种情况: ①各对映体具有相同或者相近的药理活性; ②每个对映异构体药理活性相同但作用强度却不同; ③只有其中一个对映体具有预期的药理活性，而其他的却没有药效; ④各对映异构体药理活性不同，而且其中一个可能是其消旋体药物不良反应的根源。手性药物进入人体后，在体内的吸收、分布、代谢和排泄中也可能表现出一定的立体选择性。因此对手性药物进行有效拆分，对药物的质量控制及药效评价具有重要的意义。
近几年来，超临界流体色谱法已经成为对手性药物的立体异构体进行拆分的有效方法。金薇等［5］采用Chiralcel OD 色谱柱( 250 mm × 4． 6 mm， 10 μm) ，流动相为超临界二氧化碳－ 甲醇( 含0． 1% 三氟乙酸－ 0． 1%三乙胺) ( 90∶ 10) ，背压设为15 MPa，于235nm 波长处分离依折麦布及其对映体。杨杰锋等［6］采用Chiralpak OD － H 手性色谱柱，以CO2 － 甲醇( 89∶ 11) 为流动相，检测波长为242 nm 测定碘帕醇的
对映异构体，R － 碘帕醇与S － 碘帕醇分离度良好。
张晶等［7］研究发现多数化合物在SFC 的分离效率要高于其在HPLC 上的分离效率，但HPLC 对轴手性化合物的分离效率要优于SFC。SFC 和HPLC 的分离表现出一定的互补性，随着苯环侧链烷基的碳数增加，化合物在SFC 上的保留逐渐增强，而在HPLC 的保留却逐渐减弱。张少敏等［8］ 采用ACQUITY UPC2 Trefoil CEL2 色谱柱( 150 mm × 3． 0 mm，2． 5 μm) ，以超临界
张晶等［7］研究发现多数化合物在SFC 的分离效率要高于其在HPLC 上的分离效率，但HPLC 对轴手性化合物的分离效率要优于SFC。SFC 和HPLC 的分离表现出一定的互补性，随着苯环侧链烷基的碳数增加，化合物在SFC 上的保留逐渐增强，而在HPLC 的保留却逐渐减弱。张少敏等［8］ 采用ACQUITY UPC2 Trefoil CEL2 色谱柱( 150 mm × 3． 0 mm，2． 5 μm) ，以超临界
二氧化碳－ 含0． 1%三氟乙酸的甲醇( 78∶ 22) 为流动相，背压为13． 8 MPa，于244 nm 波长处分离阿托伐他汀钙及其对映异构体。阿托伐他汀钙与其对映体在5min 内均已出峰完全，分离度达4． 1。邸士伟［9］建立了奈必洛尔关键手性中间体6 － 氟－ 3，4－ 二氢2H － 1 －苯并吡喃－ 2 － 甲酸的超临界流体色谱法，采用超临界CO2 － 甲醇( 75 ∶ 25) 结合大赛璐Chiralpak IG ( 150mm × 4． 6 mm，5 μm) 手性色谱柱直接拆分该手性中间体。
谢依棋等［10］比较了高效液相色谱( HPLC) 法与超临界流体色谱( SFC) 法拆分肾上腺素对映体。方法均使用Chiralpak AD － H 色谱柱，HPLC 法以正己烷－异丙醇－ 甲醇－ 三氟乙酸－ 乙醇胺( 88∶ 7∶ 5∶ 0． 2∶ 0． 1) 为流动相，SFC 法以CO2 － 甲醇( 含0． 2% 三氟乙酸和0． 1% 乙醇胺) ( 90∶ 10) 为流动相，检测波长均为280 nm。肾上腺素及其对映异构体在HPLC 法与SFC 法中的分离度为2． 95 和1． 86，均
谢依棋等［10］比较了高效液相色谱( HPLC) 法与超临界流体色谱( SFC) 法拆分肾上腺素对映体。方法均使用Chiralpak AD － H 色谱柱，HPLC 法以正己烷－异丙醇－ 甲醇－ 三氟乙酸－ 乙醇胺( 88∶ 7∶ 5∶ 0． 2∶ 0． 1) 为流动相，SFC 法以CO2 － 甲醇( 含0． 2% 三氟乙酸和0． 1% 乙醇胺) ( 90∶ 10) 为流动相，检测波长均为280 nm。肾上腺素及其对映异构体在HPLC 法与SFC 法中的分离度为2． 95 和1． 86，均
在0． 01 ～ 0． 10 mg /ml范围内线性关系良好。两种方法均可应用于肾上腺素对映异构体的拆分及定量，其中SFC 法更加简便、高效、绿色环保。陈香玲等［11］建立盐酸左布比卡因注射液中异构体的SFC 测定方法。色谱柱为Chiralomix SD 色谱柱( 150 mm × 4． 6 mm，3． 5μm) ，柱温为35 ℃，检测波长为215 nm，流动相为超临界二氧化碳－ 异丙醇( 73∶ 27) 。盐酸左布比卡因及其右旋异构体在0． 15 ～ 1． 5 μg /ml 范围内线性良好，其中盐酸左布比卡因与异构体定量限均为0． 15 μg /ml，检测限均为0． 075 μg /ml。Oleksandr Kozlov 等［12］采用超临界流体色谱法对一系列具有潜在抗癌活性和抗菌活性的手性吲哚类化合物进行了对映体分离。研究了流动相中多糖骨架、共溶剂类型和共溶剂含量对吲哚类化合物的保留率、对映选择性和对映拆分的影响。从27 种受试化合物中分离出26 种化合物。以直链淀粉为基础的手性固定相比纤维素为基础的手性固定相提供了更高的基线分辨率。肖梦琦等［13］采用超高效合相色谱系统对西替利嗪的左旋体和右旋体进行拆分，色谱条件使用ACQUITY UPC2 Trefoil CEL1 柱( 50 mm× 2． 1 mm，2． 5 μm) ，改性剂为甲醇－ 乙腈( 5∶ 6) 在流动相中的占比为13%、添加剂为二乙胺在改性剂中的占比为0． 8%( v /v) ，柱温45 ℃，背压1 600 psi，流速为0． 6 ml /min。此时西替利嗪对映体的分离度为2． 107，对称因子为1． 328，分离效果好。
在中药成分分析方面的应用近些年来，超临界流体色谱在中药成分分析领域发挥着日益重要的作用，传统的液相色谱难以准确分析成分复杂多样的中药样品，因而中药有效成分的分离提取始终是相关领域的一项研究重点，超临界流体色谱的应用在一定程度上解决了这些问题。亢静静等［14］将SFC 用于蛇床子中香豆素类成分的分离，使用C18柱，改性剂为甲醇，并对改性剂的比例、CO2的流速、背压和温度等参数进行了考查，以此得出优化的色谱分离条件。YangHuang 等［15］采用超临界流体色谱－ 质谱联用技术成功地分离了人参提取物中17 种苷类和人参皂苷，系统
地研究了各种实验因素对分离功能的影响，如柱型、温度和背压、改性剂和添加剂的种类、组成溶剂的浓度等。在选定的条件下，将该方法应用于14 批不同产地的人参提取物的质量评价中。吕惠生等［16］将超临界流体色谱技术应用于赤芍活性组分的分离。采用ZorbaxSB － CN 色谱柱( 250 mm × 9． 4 mm，5 μm) ，考查了夹带剂、CO2流量、温度以及压力对组分分离度的影响，得到了适宜的分离条件: 夹带剂含量13． 64%，CO2
流量20 g /min，柱温313． 15 K，柱压12 MPa。此条件下可获得纯度为94． 11% 的芍药苷和85． 65% 的芍药内酯苷产物，回收率分别为95． 6% 和88． 3%。Jie 等［17］采用SFC 对亲水性呋甾皂苷的分离进行了试验，研究了色谱条件对C － 22 位置上混合呋甾皂苷及其羟基衍生物分离的影响。对反应温度、添加剂和柱温进行了优化，采用DIOL 色谱柱，流动相A 为CO2，流动相B为甲醇( 含0． 2% 氨水和3% 水) ，梯度洗脱，在22 min
内分离出10 种相似结构的呋甾皂苷。
辛华夏等［18］建立了基于反相液相制备色谱和超临界流体制备色谱的组合方法，用于分离纯化醇提水沉后石油醚层中的海风藤。首先以甲醇作为改性剂，采用醇提水沉法去除海风藤甲醇提取物中的叶绿素，加入硅藻土后用石油醚回流富集目标成分。选用反相C18制备色谱柱将其分为18 个组分，然后将组分在SFC 模式下进行制备。选用酰胺色谱柱，以甲醇为改性剂，在柱温30 ℃、背压15． 0 MPa 的条件下分离得到6 个高纯度化合物。ZhuoShunDai 等［19］采用超临界流体色谱在线提取五味子中木脂素，实验在15 MPa、50 ℃和4 min 下进行优化，超临界CO2加入1% 甲醇，洗脱体积和流速分别设定为6 ml 和2 ml /min，将萃取液吹出罐外，分流率为2． 5%，并建立了五味子中木脂素的提取定量方法，可在19． 5 min 内完成。刘芸芸等［20］建立超临界流体色谱分离纯化木香中的木香烃内酯和去氢木香内酯的方法。采用YMC － C18色谱柱( 250 mm × 10 mm，5 μm) ，流动相SC － CO2，0． 13% 甲醇为改性剂，背压13 MPa柱温318 ℃，检测波长225 nm，在此色谱条件下SFC分离过程为正相色谱过程。超临界流体色谱方法在中药成分分离方面的应用也得益于实验条件的不断提升，其中具有代表性的一项技术为超高效合相色谱( UPC2) ，相关实验仪器因此可以实现更加稳定准确的检测结果。
王波等［21］建立了利用超高效合相色谱法( UPC2) 快速分离和测定黄芪中5 种主要黄酮类化合物( 毛蕊异黄酮、毛蕊异黄酮苷、美的紫檀素、芒柄花苷、芒柄花素) 的方法。黄芪样品采用80% 乙醇提取后，以超临界CO2 － 0． 2%H3PO4 － 甲醇溶液为流动相，梯度洗脱，色谱柱为WatersACQUITY UPC2 CSH 柱( 100 mm × 3． 0 mm，1． 8μm) ，检测波长为280 nm。5 种黄酮类成分的检出限及定量限范围分别在0． 3 ～ 0． 5 mg /kg 和1． 0 ～ 2． 0mg /kg 之间，加标平均回收率均高于99． 7%，相对标准偏差( RSD) 小于2． 2% ( n = 6) 。袁云等［22］为了分离瓜蒌子，创新性地结合了离线二维反相液相色谱方法与超临界流体色谱方法，其中前者被应用于实验的第一维，即按色谱峰采集样品中制备的12 个组分，后者被应用于实验的第二维，即将第一维得到的组分再次分离。SFC 方法采用了乙醇－ 正己烷( 3∶ 7) 的混合溶剂作为改性剂，既提供了适当的洗脱能力，也保证了在上样量增加时满足样品溶解的要求。
辛华夏等［18］建立了基于反相液相制备色谱和超临界流体制备色谱的组合方法，用于分离纯化醇提水沉后石油醚层中的海风藤。首先以甲醇作为改性剂，采用醇提水沉法去除海风藤甲醇提取物中的叶绿素，加入硅藻土后用石油醚回流富集目标成分。选用反相C18制备色谱柱将其分为18 个组分，然后将组分在SFC 模式下进行制备。选用酰胺色谱柱，以甲醇为改性剂，在柱温30 ℃、背压15． 0 MPa 的条件下分离得到6 个高纯度化合物。ZhuoShunDai 等［19］采用超临界流体色谱在线提取五味子中木脂素，实验在15 MPa、50 ℃和4 min 下进行优化，超临界CO2加入1% 甲醇，洗脱体积和流速分别设定为6 ml 和2 ml /min，将萃取液吹出罐外，分流率为2． 5%，并建立了五味子中木脂素的提取定量方法，可在19． 5 min 内完成。刘芸芸等［20］建立超临界流体色谱分离纯化木香中的木香烃内酯和去氢木香内酯的方法。采用YMC － C18色谱柱( 250 mm × 10 mm，5 μm) ，流动相SC － CO2，0． 13% 甲醇为改性剂，背压13 MPa柱温318 ℃，检测波长225 nm，在此色谱条件下SFC分离过程为正相色谱过程。超临界流体色谱方法在中药成分分离方面的应用也得益于实验条件的不断提升，其中具有代表性的一项技术为超高效合相色谱( UPC2) ，相关实验仪器因此可以实现更加稳定准确的检测结果。
王波等［21］建立了利用超高效合相色谱法( UPC2) 快速分离和测定黄芪中5 种主要黄酮类化合物( 毛蕊异黄酮、毛蕊异黄酮苷、美的紫檀素、芒柄花苷、芒柄花素) 的方法。黄芪样品采用80% 乙醇提取后，以超临界CO2 － 0． 2%H3PO4 － 甲醇溶液为流动相，梯度洗脱，色谱柱为WatersACQUITY UPC2 CSH 柱( 100 mm × 3． 0 mm，1． 8μm) ，检测波长为280 nm。5 种黄酮类成分的检出限及定量限范围分别在0． 3 ～ 0． 5 mg /kg 和1． 0 ～ 2． 0mg /kg 之间，加标平均回收率均高于99． 7%，相对标准偏差( RSD) 小于2． 2% ( n = 6) 。袁云等［22］为了分离瓜蒌子，创新性地结合了离线二维反相液相色谱方法与超临界流体色谱方法，其中前者被应用于实验的第一维，即按色谱峰采集样品中制备的12 个组分，后者被应用于实验的第二维，即将第一维得到的组分再次分离。SFC 方法采用了乙醇－ 正己烷( 3∶ 7) 的混合溶剂作为改性剂，既提供了适当的洗脱能力，也保证了在上样量增加时满足样品溶解的要求。
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