手机版|
二维码|
2.金粉的处理 取60mg金粉或钨粉置于离心管中． 加人1ml无水乙醇， 充分振荡3min。 离心1min, 去上清， 再加人1ml 无菌水充分混匀后， 离心， 重复上述步骤3次. 最后， 将金粉悬浮千1ml 无菌蒸熘水中， 于4℃或室温下储存。
3.DNA 的处理 取5ul金粉悬浮液， 依次加人5ul 的质粒DNA (1.0ug/ul) 溶液、50μl 0.1mol/l亚精胺（所用的溶液经无菌消毒）， 振荡3min 后， 在室温下放置10min,离心10s，弃去上清液；加人250ul无水乙醇,振荡后以离心10s, 弃上清液。沉淀重新悬浮千60ul无水乙醇中， 可供5 枪（每枪10ul) 使用。
4．基因枪的操作
基因枪的所有操作均在无菌条件下进行， 具体步骤如下：
1) 先用70％乙醇对基因枪表面及样品室进行消毒。同时， 用70%乙醇将阻挡网和可裂圆片， 微弹载体及其固定器、固定工具没泡15min 后， 放在超净台上晾干。可裂膜片、固定盖、微弹载体发射装置可用70 ％乙醇进行表面灭菌， 吹干。
2) 将微粒载片嵌人固定环中，取DNA 及金粉的混合物加于彶粒载片中心， 干燥1min 左右。
3)安装可裂膜于其托座上， 顺时针拧到气体加速器上。
4)将空间环、阻挡网、阻挡网托座、微粒载片及固定环（带有微粒的一面朝下）安装好， 旋紧盖子， 插人抢中。
5)把样品放在轰击室中， 关好门。
6)打开氦气瓶的总阀， 顺时针转氦气调节阀， 使氦压表指针的示数高于可裂膜压力200Psi (= 1. 379MPa) 。
7)打开基因枪及变压器开关。
8) 按动真空键， 待其空度至26~28in Hg (=88. 05~94. 82kPa) 时， 迅速按下Hold 键， 接若按住发射键并保持不动， 直到激发为止。
9)按通气键待真空表归笭后， 取出样品．
10) 关机。把氮气瓶的总开关旋紧， 打一次空枪， 把釭压表指针归笭后， 再逆时针旋转氮压表调节阀；关闭基因枪的总开关及变压器开关。
5.注意事项
1 ) 质粒ONA 的储存浓度在枪击前尿好调至1ug/ul ， 这样有利于制备微粒子弹时的DNA取样。质粒ONA 与金粉形成复合体的比例以0. 75～1ug/mg（金粉）为宜。
2) 质粒DNA 的纯度和浓度是影响转化率的重要参数之一． 一般每枪用O. 75~1μg DNA。
3) 亚精胺最好是现用现配， 或者储存于-20 ℃冰箱中（时间不超过1 个月）。如没有保存好或保存时间过长， 亚精胺会发生降解，从而影响DNA 吸附于金属微粒表面的能力。
4)对于植物材料转化， 微粒子弹载体的选择视受体材料而定。此外， 可裂圆片的规格应与微粒子弹载体对应。
