蛋白质样品的提取和分离是整个蛋白质纯化过程的第一步，在蛋白质纯化中首先要获得蛋白质的提取液，恰当地选择蛋白质提取及分离的方法将有助于随后的纯化过程。对于固态样品材料，一般先进行目的蛋白的提取，然后分离纯化。对于微生物发酵或动植物细胞培养得到的悬浮液，具体的操作方法视蛋白质在细胞内外的位置而不同。对于细胞内蛋白质，必须先破碎细胞。在发酵罐中生长的细胞要先浓缩，从而提高细胞破碎的效率。在细胞破碎过程中加入蛋白酶的抑制剂，可避免因细胞破碎而释放出的蛋白酶的作用，应尽量缩短操作时间并且在较低温度下（比如４℃）操作。细菌细胞和细胞碎片难于离心或过滤除去，因为它们太小、可压缩。采用絮凝方法有助于除去这些颗粒。对于细胞外蛋白质，目的蛋白存在于悬浮液中，可直接采用离心、过滤等操作来进行固液分离，除去细胞和其他颗粒物质，以排除它们对随后的纯化过程的干扰。提取液若准备进入色谱柱，则必须先除去所有颗粒物质，以免污染和堵塞色谱柱。如果提取液随后要进行沉淀，对少量颗粒物质可以忽略不处理，它们会在沉淀过程中聚沉而被除去。
      对蛋白质样品的提取应尽量多地提取出目的蛋白，并且保持其活性少受损失，避免目的蛋白因热、ｐＨ 或存在有机溶剂、金属离子、蛋白酶等因素而损失活性。蛋白质的提取常用各种水溶液，一般在偏离蛋白质等电点０.５ｐＨ 单位以上，此时蛋白质的溶解度增加。提取等电点在碱性范围的蛋白质，可以用稀酸；对等电点在酸性范围的蛋白质，可以用稀碱提取，以尽可能提高目的蛋白在提取液中的溶解度。但是也要注意提取液的ｐＨ 应该在目的蛋白稳定的范围内，避免极端ｐＨ。提取液的离子强度一般不能太高，以免引起盐析。提取液与提取物的比例通常为５∶１，比例如果过大，会影响到随后纯化过程所用时间及纯化效率。比如，研究固体培养的麦曲中酶系统，可以用５倍于麦曲重量的适当ｐＨ 的缓冲液，在４℃浸泡麦曲过夜，然后进行过滤即可。
     细胞破碎后进行目的蛋白的提取。大部分目的蛋白保留在液相中，为了减少损失，常用大量的缓冲液。对于动物组织，破碎用缓冲液体积为动物组织的２～２.５倍；对于植物细胞，可以用较少数量的缓冲液来提取。选择破碎细胞用的缓冲液受到目的蛋白的稳定性和可溶性的影响，并且受到随后的纯化过程的影响，可以用水，但是会造成离子强度和ｐＨ 降低。在低离子强度和ｐＨ 下，很多蛋白质不可溶，或者失去活性。接近细胞生理条件（比如ｐＨ≈７、０.１５ｍｏｌ／ＬＮａＣｌ）对于提取大多数蛋白质都很有效。常用ｐＨ＝７～７.５、２０～５０ｍｍｏｌ／Ｌ磷酸钠，

或ｐＨ７.５、０.１ｍｏｌ／ＬＴｒｉｓ ＨＣｌ（含０～０.１５ｍｏｌ／ＬＮａＣｌ）缓冲液。
     双水相萃取法（ｔｗｏａｑｕｅｏｕｓｐｈａｓｅｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ）是近年发展起来、目前已较广泛用于蛋白质分离纯化的方法，利用目的蛋白和杂质在两相中不同的分配，进行目的蛋白的分离。该法能够保留蛋白质的活性，在提取蛋白质的同时还能起到纯化作用，收率较高。使用较多的是聚乙二醇（ｐｏｌｙｅｔｈｙｌｅｎｅｇｌｙｃｏｌ，ＰＥＧ）／葡聚糖体系和聚乙二醇／无机盐体系。比如，采用ＰＥＧ４０００／葡聚糖从破碎的细胞中分离甲酸脱氢酶，收率在９０％以上；采用ＰＥＧ１５５０／磷酸钾分离β葡萄糖苷酶，收率达到９８％。采用双水相分离法可以直接在细胞破碎后进行目的蛋白的提取，目的蛋白常分布在上相并得到浓缩，细胞碎片等固体物分布在下相中。