测定蛋白质浓度的方法
蛋白质的含量测定是生物化学研究中最常用、最基本的分析方法之一。常用的经典方法有定氮法、双缩脲法（Ｂｉｕｒｅｔ法）、Ｆｏｌｉｎ酚试剂法（Ｌｏｗｒｙ法）、紫外吸收法，目前普遍使用的新测定法有Ｂｒａｄｆｏｒｄ法（考马斯亮蓝法）和银染色法。每种测定方法都有优缺点。定氮法操作复杂但结果较准确，其他方法中使用的标准蛋白质多以定氮法来测定蛋白质含量。双缩脲法虽然灵敏度差，但是干扰物质少，可用于无需十分精确的蛋白质快速测定。Ｂｒａｄｆｏｒｄ法和Ｌｏｗｒｙ法的灵敏度比紫外吸收法高１０～２０倍，比双缩脲法灵敏１００倍以上。Ｂｒａｄｆｏｒｄ法具有快速、高灵敏度的突出优点，应用越来越广泛。利用微波改良的Ｌｏｗｒｙ法和二喹啉甲酸（ＢＣＡ）法可在极短的时间内精确测定蛋白质浓度，非常有利于常规检测。在蛋白质的分离纯化过程中，测定溶液中蛋白质的总量或某一蛋白质的含量是常规要求，在选择测定方法时应考虑：测定方法的灵敏度及精确度能否满足要求，所需蛋白质样品的量以及测定后能否回收，蛋白质的性质，可能存在的干扰物质，所需的仪器和花费时间以及操作是否简单容易，测定结果是绝对值（近似值）还是相对值（标准的比值）等。简要介绍各种测定方法的基本原理、测定方法、要点以及改良操作。
紫外分光光度法
紫外分光光度法
蛋白质分子中的酪氨酸、苯丙氨酸和色氨酸残基的苯环含有共轭双键，使蛋白质具有吸收紫外光的性质。最大吸收峰（λｍａｘ）２８０ｎｍ处的吸光度与蛋白质含量成正比。此外，蛋白质溶液在２３８ｎｍ 的光吸收值与肽键含量成正比。利用一定波长下，蛋白质溶液的光吸收值与蛋白质浓度的正比关系，通过简单的分光光度计可以定量测定溶液中的蛋白质含量。
紫外吸收法简便、灵敏、快速，不消耗样品，测定后仍能回收使用。大多数缓冲液和低浓度的盐不干扰测定，因而特别适用于柱色谱洗脱液的快速连续检测，此时只需测定蛋白质浓度的变化，而非绝对值。此法的特点是测定蛋白质含量的准确度较差，干扰物质多。在用标准曲线法测定蛋白质含量时，对那些与标准蛋白质中酪氨酸和色氨酸含量差异大的蛋白质有一定的误差。故该法适于用测定与标准蛋白质氨基酸组成相似的蛋白质。
紫外吸收法简便、灵敏、快速，不消耗样品，测定后仍能回收使用。大多数缓冲液和低浓度的盐不干扰测定，因而特别适用于柱色谱洗脱液的快速连续检测，此时只需测定蛋白质浓度的变化，而非绝对值。此法的特点是测定蛋白质含量的准确度较差，干扰物质多。在用标准曲线法测定蛋白质含量时，对那些与标准蛋白质中酪氨酸和色氨酸含量差异大的蛋白质有一定的误差。故该法适于用测定与标准蛋白质氨基酸组成相似的蛋白质。
（1）近ＵＶ （２８０ｎｍ）光吸收法
测定蛋白质溶液在２８０ｎｍ的吸光度值是最常用的紫外吸收法。在近ＵＶ区，蛋白质的吸光度主要取决于其中的酪氨酸和色氨酸残基的含量，此外，在很小程度上，还取决于苯丙氨酸和二硫键的含量。
这种测定方法操作简单、快速、灵敏，且样品可回收，低浓度的盐不干扰测定，因而被广泛应用于蛋白质制备中，特别适用于柱色谱分离中的样品测定，便于连续自动装置的使用。但是测定准确度较差，不是严格的定量方法，适用于粗提蛋白的测定。
（2）肽键测定法
考马斯亮蓝染色法这种测定方法操作简单、快速、灵敏，且样品可回收，低浓度的盐不干扰测定，因而被广泛应用于蛋白质制备中，特别适用于柱色谱分离中的样品测定，便于连续自动装置的使用。但是测定准确度较差，不是严格的定量方法，适用于粗提蛋白的测定。
（2）肽键测定法
肽键在远ＵＶ区有强吸收，最大吸收峰λｍａｘ在１９０ｎｍ，但由于氧的吸收和分光光度计的输出困难，一般选用２３８ｎｍ测定。蛋白质溶液在２３８ｎｍ处的光吸收强弱与肽键的含量成正比。
这种测定方法简单、灵敏，样品可回收，对于不同蛋白质的光吸收变化很小。蛋白质溶液进行柱色谱分离时，用２３８ｎｍ 检测洗脱液的蛋白质峰位，比２８０ｎｍ吸收法灵敏。但是测定时需要在远ＵＶ 区校正分光光度计的精度，许多缓冲液和多种有机化合物（如醇、酮、醛、醚、有机酸、酰胺类和过氧化物、血红素等）在此区域有强吸收，干扰因素较多。最好用无机盐、无机碱和水溶液进行测定。含有有机溶剂的样品，经蒸干或其他方法去除干扰物质后，用水、稀酸或稀碱溶解测定。
(3)吸光度差异法
这种测定方法简单、灵敏，样品可回收，对于不同蛋白质的光吸收变化很小。蛋白质溶液进行柱色谱分离时，用２３８ｎｍ 检测洗脱液的蛋白质峰位，比２８０ｎｍ吸收法灵敏。但是测定时需要在远ＵＶ 区校正分光光度计的精度，许多缓冲液和多种有机化合物（如醇、酮、醛、醚、有机酸、酰胺类和过氧化物、血红素等）在此区域有强吸收，干扰因素较多。最好用无机盐、无机碱和水溶液进行测定。含有有机溶剂的样品，经蒸干或其他方法去除干扰物质后，用水、稀酸或稀碱溶解测定。
(3)吸光度差异法
当蛋白质样品中存在具有紫外吸收的干扰物时，利用在不同紫外光波下的光吸收值的差异，来测定蛋白质的含量。
Ｌｏｗｒｙ法
又称为Ｆｏｌｉｎ酚试剂法，最早是由Ｌｏｗｒｙ确定蛋白质浓度测定的基本步骤，以往在生物化学领域中广泛应用。Ｌｏｗｒｙ法的显色原理是根据双缩脲反应，蛋白质中的肽键在碱性条件下与Ｃｕ２＋ 反应，生成紫红色Ｃｕ＋ 复合物。Ｆｏｌｉｎ酚试剂在Ｃｕ＋ 的催化下，磷钼酸磷钨酸盐被蛋白质中的芳香族氨基酸残基还原，产生深蓝色的钼蓝和钨蓝混合物，其最大吸收峰在７４５～７５０ｎｍ处。在一定的浓度范围内，所形成蓝色的深浅与蛋白质含量之间有线性关系，可用于蛋白质含量的测定。
二喹啉甲酸检测法
又称为Ｆｏｌｉｎ酚试剂法，最早是由Ｌｏｗｒｙ确定蛋白质浓度测定的基本步骤，以往在生物化学领域中广泛应用。Ｌｏｗｒｙ法的显色原理是根据双缩脲反应，蛋白质中的肽键在碱性条件下与Ｃｕ２＋ 反应，生成紫红色Ｃｕ＋ 复合物。Ｆｏｌｉｎ酚试剂在Ｃｕ＋ 的催化下，磷钼酸磷钨酸盐被蛋白质中的芳香族氨基酸残基还原，产生深蓝色的钼蓝和钨蓝混合物，其最大吸收峰在７４５～７５０ｎｍ处。在一定的浓度范围内，所形成蓝色的深浅与蛋白质含量之间有线性关系，可用于蛋白质含量的测定。
二喹啉甲酸检测法
由Ｓｍｉｔｈ等首先提出的二喹啉甲酸（ＢＣＡ）检测法，反应简单而且没有太多的干扰物影响。反应原理和Ｌｏｗｒｙ法类似，在碱性条件下，蛋白质分子中的肽键能与Ｃｕ２＋ 络合生成络合物，同时将Ｃｕ２＋ 还原成Ｃｕ＋。Ｃｕ＋ 与ＢＣＡ试剂特异性结合，形成稳定的深紫红色复合物，其最大吸收在５６２ｎｍ。因为反应中产生的Ｃｕ＋ 是蛋白浓度和保温时间的函数，颜色的深浅与蛋白质浓度成正比，所以可根据吸光度值与已知浓度的蛋白质标准进行比较，来测定未知蛋白样品的浓度。
１９７６年，Ｂｒａｄｆｏｒｄ根据蛋白质与染料相结合的原理建立了考马斯亮蓝染色法，也称Ｂｒａｄｆｏｒｄ检测法，这是目前灵敏度最高的蛋白质测定方法。其检测原理为：在酸性分析试剂溶液中，染料考马斯亮蓝Ｇ２５０与蛋白质结合的主要是阴离子形式的蓝色，其最大吸收峰（λｍａｘ）位置在５９０ｎｍ，形成的复合物颜色的深浅与蛋白浓度的高低成正比关系。因此，通过测定染料的蓝色离子态可以定量测定蛋白质，通常测定５９５ｎｍ下的吸光度。考马斯亮蓝法目前已成为应用最广泛的蛋白质含量测定方法，Ｂｉｏ-Ｒａｄ公司的蛋白质定量检测试剂盒就是应用该检测法。与Ｌｏｗｒｙ法相比，Ｂｒａｄｆｏｒｄ法操作更方便简单，而且快速，灵敏度更高，受生物样品中的非蛋白质组分和常用试剂的干扰更少。
