一、标本的采集与送检
病毒标本的采集与送检直接影响病毒感染的检查结果,标本采集和送检过程中应注意下列原则。
(1)根据临床诊断及病程采集合适标本。如上呼吸道感染时取鼻咽分泌物,神经系统感染时取脑脊液,肠道感染时取粪便,病毒血症期取血液等。用千病毒的分离或病毒核酸检测的标本应采集急性期标本,此时病毒量多,检出率高。
(2)标本采取必须严格遵守无菌操作要求,取材时应尽量避免外界污染。对千本身有杂菌污染的标本,可根据污染菌的种类选用抗生素处理。
(3)采取标本后应低温保存并尽快送检。
(4)用于血清学诊断的标本,应在急性期和恢复期各取一份血清,以便动态观察血清抗体效价的变化。
二病毒的形态检查
1.光学显微镜检查仅用于病毒包涵体及某些大颗粒病毒(如癒类病毒)的检查,根据包涵体的特点,可做出辅助诊断。
2.电子显微镜检查用电子显微镜可直接观察病毒颗粒的形态、结构以及病毒引起的组织细胞病理变化。也可用免疫电镜法检查,即将标本与特异抗血清混合使病毒颗粒凝聚,再用电镜观察,可提高检出率。
三、病毒的分离与鉴定
1. 动物接种品原始的病毒培养方法,目前用得不多。常用的动物有小鼠、大鼠、豚鼠、家兔和猴等。根据病者种类不同,选择敏感动物及适宜接种部位,如嗜神经性病毒可接种于小鼠脑内,柯萨奇病毒可接种千乳鼠腹腔内。
2. 鸡胚培养鸡胚对多种病燕敏感。一般采用孵化9~14天的鸡胚,根据病毒种类不同,将和细胞培养。病毒标本接种于鸡胚的不同部位.最常用的接种部位有羊膜腔、尿襄腔、绒毛尿囊膜和卵黄襄等。
3. 细胞培养病毒分离鉴定中最常用的基本方法。用于组织培养的细胞包括原代细胞、二倍体细胞和传代细胞系。常用的组织培养细胞有人胚肾细胞、Hela细胞、猴肾细胞等。大多数病繇在敏感细胞内增殖后,可引起细胞变圆、聚集、坏死、溶解或脱落、细胞融合形成多核巨细胞,形成包涵体等细胞形态学改变,是病毒增殖的重要指标。有些病毒增殖后可使宿主细胞膜抗原改变,使之能与红细胞结合,称为红细胞吸附现象,也可作为病毒增殖生长的指标。
四、病毒感染的血清学诊断
1. 病毒抗原的检测用已知的病毒特异性抗体检测标本中病毒的抗原。具有特异性强、灵敏度高、检测快速等诸多优点。常用的诊断试剂是单克隆抗体。常用的方法为酶联免疫吸附试验和免疫荧光技术等。
2. 病毒抗体的检测用已知的病毒特异性抗原检测患者血清中相应的抗体,是病毒性疾病知识点:检刹病诊断的主要方法。抗体检测时需要采集患者双份血清,若恢复期血清抗体效价比急性期增高4倍或以上才有诊断意义。标本中病毒的特异性lgM抗体的检测,对病毒感染的早期诊断有着重要的意义。
五、病毒核酸检测
实验诊断正由生化诊断、免疫诊断向基因诊断的新时代迈进。由于检测病毒核酸可做出快速诊断,故在诊断中应用越来越广泛。
l. 核酸杂交技术一种特异、快速、能定量分型、应用面广的诊断新技术,原理是用已知序列的单链核酸标记上同位素作为探针,检测标本中同源或部分同源的病毒核酸。其常用方法有斑点杂交、细胞内原位杂交、DNA印迹杂交、RNA印迹杂交等。
2. 聚合酶链反应一种快速体外扩增特异性DNA片段的新技术。它在数小时内可使目的基因扩增数百万倍,可测出极微员的基因,因此敏感性极高。需注意因操作时污染而出现的假阳性。
3. 基因芯片技术基因芯片技术又称DNA芯片、生物芯片,是继分子克隆、单克隆抗体和PCR之后出现的又一生物高科技技术。其原理是将已知的生物分子探针或基因探针,大规模或有序排布千小块硅片等载体上,与待检样品中的生物分子或基因序列相互作用和并行反应,在激光的激发下,产生的荧光信号被接收器收集,计算机自动分析处理数据并报告结果。其优点是可以一次性完成大批样品DNA序列的检测和分析,解决了传统核酸杂交技术的许多不足,有着广阔的应用前景。